viernes, 25 de mayo de 2012
jueves, 24 de mayo de 2012
Tinciones para la evaluación de morfología microscópica
El Clostridium botulinum es una bacteria
Gram positiva, anaerobia que tiene forma de varilla y se desarrollan mejor en
condiciones de poco oxígeno. Las bacterias forman esporas que les permiten
sobrevivir en un estado latente hasta ser
expuestas a condiciones que puedan sostener su crecimiento y estas se presentan
de forma ovalada subterminal y deformante. Es móvil por flagelos peritricos, no produce cápsula y es
proteolíco y lipolítico.
Para
evaluar la presencia de este microorganismo se realizará un frotis a partir de
la muestra obtenida, tomando el inóculo en condiciones de esterilidad y
colocándolo en el frotis, fijándolo (dependiendo del tipo de muestra que se
toma, ya sea líquida o sólida). Por disposición de la norma oficial mexicana
NOM-129-SSA1-1995 Si el alimento contiene exceso de grasa, sumergir los
portaobjetos fijados al calor por 1-2 minutos en xilol antes de teñir.
Después
de estar seco el frotis se colocará el colorante cristal violeta por 30
segundos sobre el frotis, seguido de lavar el colorante con agua destilada.
Después de esto se adicionan dos gotas de Lugol por otros treinta segundos,
lavándolo con agua destilada.
Siguiente a esto se lava el colorante en exceso
con alcohol-cetona hasta que deje de escurrir el colorante y se lava con agua
destilada.
Finalmente se colocan dos gotas de safranina durante 30 segundos y
se lava el frotis con agua destilada.
Al
observar al microscopio se debe observar una estructura como la descrita en la
imagen, así como el color violeta definido por el cristal violeta:
Técnica de siembra a utilizar
Al ser
un microorganismo anaerobio, la siembra que procede a realizarse es por picadura
en todos los agares, y crear una condición de anaerobiosis.
Figura representativa de como realizar la siembra por picadura:
Siembra por picadura: Asa recta, tomar muestra, sembrar en agar semisólido, forma vertical
Figura representativa de como realizar la siembra por picadura:
Siembra por picadura: Asa recta, tomar muestra, sembrar en agar semisólido, forma vertical
Medios de cultivo para Clostridium botulinum
Medio carne cocida (CMM)
Cuadro 1. Formula del medio carne cocida
Componente
|
Cantidad
|
Corazón de res
|
454 g
|
Proteosa peptona
|
20 g
|
Bactodextrosa
|
2 g
|
Cloruro de sodio
|
5 g
|
Extracto de corazón de res
|
1000 ml
|
Modo de preparación:
·
Picar
el corazón de res, sumergir en agua y calentar hasta ebullición durante 1 h.
Enfriar, ajustar el pH a 7,0, y hervir 10 minutos ç
·
Filtrar
a través de muselina y presionar para drenar el exceso de líquido de la carne.
Guardar la carne cocida.
·
Agregar
los ingredientes al filtrado y ajustar a pH 7,0, agregar agua hasta hacer 1000
ml.
·
Filtrar a través de papel filtro poroso. Se
puede conservar el caldo y la carne en congelación por separado.
·
Agregar el corazón
cocido y picado a tubos de ensaye de 18 x 150 mm o 20 x 150 mm a una altura de
1,2 a 2,5 cm del tubo y adicionar de 10 a 12 ml del caldo.
· Esterilizar en autoclave
15 minutos a 121ºC. Si este medio se almacena por más de 12 h después de su
preparación, debe calentarse a ebullición por 10 minutos y enfriar antes de su
uso.
Caldo tripticasa peptona glucosa extracto de levadura (TPGY). Medio selectivo
Cuadro 2: Formula de caldo TPGY
Componente
|
Cantidad
|
Tripticasa
|
50 g
|
Peptona
|
5 g
|
Glucosa
|
4 g
|
Extracto de levadura
|
20 g
|
Tioglicolato de sodio
|
1 g
|
Agua destilada
|
1000 ml
|
Modo de preparación
·
Disolver los
ingredientes en agua caliente, enfriar y ajustar a pH 7,2.
·
Distribuir en volúmenes
de 21 ml en tubos de 20 x 150 mm con tapón de rosca.
·
Esterilizar por vapor
·
Enfriar a la temperatura
y almacenar a 4ºC hasta 6 semanas. Si se almacena más de 12 h, tratarlos con
calor
Caldo tripticasa peptona glucosa
extracto de levadura adicionado con tripsina (TPGYT). Medio selectivo
Cuadro 3. Formula del caldo TPGYT
Componente
|
Cantidad
|
Tripticasa
|
50 g
|
Peptona
|
5 g
|
Glucosa
|
4 g
|
Extracto de levadura
|
20 g
|
Tioglicolato de sodio
|
1 g
|
Agua destilada
|
1000 ml
|
Modo de preparación
·
Disolver los
ingredientes en agua caliente, enfriar y ajustar a pH 7,2.
·
Distribuir en volúmenes
de 2 ml en tubos de 20 x 150 mm con tapón de rosca.
·
Esterilizar por vapor
fluente, enfriar a la temperatura y almacenar a 4ºC hasta 6 semanas. Si se
almacena más de 12 h. tratarlos con calor
·
Agregar 1,5 ml de
solución de tripsina al 1,4% por cada tubo con 21 ml del medio TPGY. Mezclar
muy suavemente. Este medio no se puede almacenar.
Agar hígado de ternera
Cuado 4: Formula Agar de hígado de ternera
Componente
|
Cantidad
|
Infusión de hígado
|
50 g
|
Infusión de ternera
|
500 g
|
Proteosa peptona
|
20 g
|
Neopeptona
|
1,3 g
|
Triptona
|
1,3 g
|
Dextrosa
|
5,0 g
|
Almidón soluble
|
10,0 g
|
Caseína isoeléctrica
|
2,0 g
|
Cloruro de sodio
|
5,0 g
|
Nitrato de sodio
|
2,0 g
|
Gelatina
|
20,0 g
|
Agar
|
15,0 g
|
Agua destilada
|
1000 ml
|
Modo de preparación
·
Calentar con agitación
constante hasta dilución completa.
·
Esterilizar en autoclave
por 15 minutos a 121ºC, pH final 7,3 0,2.
·
Agregar por cada 500 ml del
medio base fundido 40 ml de la suspensión salina de yema de huevo.
·
Mezclar y vaciar a cajas
de Petri estériles de 15 x 100 mm (aproximadamente 15 - 20 ml).
·
Secar las placas a
temperatura del laboratorio por 2 días o a 35ºC por 24 horas.
·
Verificar esterilidad de
las placas.
·
Almacenar en
refrigeración.
Emulsión
al 50% de yema de huevo.
· Lavar los huevos con un cepillo suave y dejar
escurrir. Sumergirlos por 1 hora en solución de cloruro mercúrico al 0,1%,
escurrir. Sumergir en una solución de etanol al 70% y dejar durante 30 minutos,
escurrir. Abrir los huevos en condiciones asépticas y descartar las claras.
Colocar las yemas en un recipiente estéril y mezclar con igual volumen de
solución salina fisiológica (0,85%) estéril. Guardar en refrigeración hasta su
uso.
Agar para esporulación de Eklund.
Cuadro 5. Formula Agar
para esporulación de Eklund
Componente
|
Cantidad
|
Tripticasa
|
4
g
|
Peptona
|
1
g
|
Glucosa
|
0,1 g
|
Extracto
de levadura
|
1
g
|
Aga
|
4
g
|
Agua
destilada
|
200
ml
|
Modo de preparación:
· Disolver los ingredientes en agua caliente,
excepto el agar.
· Ajustar a pH 7,8,
· Agregar el agar.
· Esterilizar por vapor y enfriar a 50ºC.
· Agregar 2 ml de solución al
10% de clorhidrato de cisteína, esterilizada por filtración; 12 ml de emulsión
de yema de huevo y 2 ml de sangre citratada de bovino o borrego.
· Preparar las placas.
*Este medio es
particularmente adecuado para la esporulación de C. botulinum del grupo II
Agar para asilamiento de C. botulinum
(CBI).
·
El agar CBI es una
modificación del medio agar McClung Toabe para el aislamiento selectivo y
diferencial de C. botulinum, el cual puede aislarse de los
cultivos toxigénicos de CMM, provenientes de muestras de heces, líquido
gástrico o alimentos.
·
El medio de agar CBI
contiene:
Cicloserina 250 g/ml
Sulfametoxazol 76 g/ml
Trimetroprim 4 g/ml
·
Todo esto en la base del
medio agar McClung Toabe yema de huevo.
Agar McClung Toabe
Cuadro 6: Formula Agar McClung Toabe
Componente
|
Cantidad
|
Proteosa peptona
|
40 g
|
Bacto dextrosa
|
2 g
|
Fosfato de sodio dibásico
|
1 g
|
Fosfato de potasio monobásico
|
1 g
|
Cloruro de sodio
|
2 g
|
Sufato de magnesio
|
0,1 g
|
Agar
|
25 g
|
Agua destilada (pH final 7,6 ± 0,2 a 25ºC)
|
1000 ml
|
Extracto de levadura
|
5 g
|
Suspensión de yema de huevo
|
100 ml
|
SOLUCION DE ANTIBIOTICOS
Cicloserina
250 mg o 25 ml de una solución al 0,1%
Sufametoxasol 76 mg o 4 ml de una solución al 1,9%
Disolver el sulfametoxazol en solución 2 N de NaOH.
Sufametoxasol 76 mg o 4 ml de una solución al 1,9%
Disolver el sulfametoxazol en solución 2 N de NaOH.
Lactato
deTrimetroprim 4 mg o 4 ml de una solución al 0,1%
por cada 100 ml de medio base
por cada 100 ml de medio base
Esterilizar por filtración.
Modo de Preparación:
·
Agregar el extracto de levadura y los
ingredientes del agar McClug Toabe a un matraz de 2 L con 900 ml de agua
destilada,
· Mezclar y calentar hasta disolución. Ajustar
a pH 7,5. Esterilizar 15 minutos a 121ºC en autoclave.
· Enfriar a 55ºC en baño de agua y en
condiciones asépticas agregar 100 ml de la suspensión al 50% de yema de huevo.
·
Agregar los volúmenes necesarios para
conservar la concentración de antibióticos por litro de media base.
·
Mezclar y distribuir en cajas de Petri
estériles de 15 x 100 mm aproximadamente 15-20 ml por placa.
·
Dejar solidificar y colocar en bolsas de
plástico.
·
Guardar en refrigeración hasta su uso. Estas
placas pueden almacenarse hasta 1 mes aproximadamente.
Nota :
·
Si los cultivos son toxigénicos, se debe
Sembrar directamente en agar hígado de ternera yema de huevo o en agar para el
aislamiento de Clostridium botulinum (CBI),
·
el caso de ausencia de esporas, reincubar los
tubos (Eklund).Seleccionar
colonias bien aisladas sobre el agar hígado de ternera yema de huevo que
presenten un halo opaco indicativo de lipolisis y pasarlas a caldo TPGY.
Seleccionar otras colonias del medio agar para el aislamiento de C. botulinum
rodeadas de un halo opaco con brillo aperlado y pasar a caldo TPGY. Incubar a
30ºC durante 5 días.
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