jueves, 24 de mayo de 2012

Tinciones para la evaluación de morfología microscópica


El Clostridium botulinum es una bacteria Gram positiva, anaerobia que tiene forma de varilla y se desarrollan mejor en condiciones de poco oxígeno. Las bacterias forman esporas que les permiten sobrevivir en un estado latente hasta ser expuestas a condiciones que puedan sostener su crecimiento y estas se presentan de forma ovalada subterminal y deformante. Es móvil por flagelos  peritricos, no produce cápsula y es proteolíco y lipolítico.

Para evaluar la presencia de este microorganismo se realizará un frotis a partir de la muestra obtenida, tomando el inóculo en condiciones de esterilidad y colocándolo en el frotis, fijándolo (dependiendo del tipo de muestra que se toma, ya sea líquida o sólida). Por disposición de la norma oficial mexicana NOM-129-SSA1-1995 Si el alimento contiene exceso de grasa, sumergir los portaobjetos fijados al calor por 1-2 minutos en xilol antes de teñir. 

Después de estar seco el frotis se colocará el colorante cristal violeta por 30 segundos sobre el frotis, seguido de lavar el colorante con agua destilada. 

Después de esto se adicionan dos gotas de Lugol por otros treinta segundos, lavándolo con agua destilada. 

Siguiente a esto se lava el colorante en exceso con alcohol-cetona hasta que deje de escurrir el colorante y se lava con agua destilada. 

Finalmente se colocan dos gotas de safranina durante 30 segundos y se lava el frotis con agua destilada.

Al observar al microscopio se debe observar una estructura como la descrita en la imagen, así como el color violeta definido por el cristal violeta:

Gram positiva vista al microscopio

Técnica de siembra a utilizar


Al ser un microorganismo anaerobio, la siembra que procede a realizarse es por picadura en todos los agares, y crear una condición de anaerobiosis.


Figura representativa de como realizar la siembra por picadura:
Siembra por picadura: Asa recta, tomar muestra, sembrar en agar semisólido, forma vertical

Medios de cultivo para Clostridium botulinum

Medio carne cocida (CMM)






Cuadro 1. Formula del medio carne cocida
Componente
Cantidad
Corazón de res
454 g
Proteosa peptona
20 g
Bactodextrosa
2 g
Cloruro de sodio
5 g
Extracto de corazón de res
1000 ml

Modo de preparación:

·         Picar el corazón de res, sumergir en agua y calentar hasta ebullición durante 1 h. Enfriar, ajustar el pH a 7,0, y hervir 10 minutos ç
·         Filtrar a través de muselina y presionar para drenar el exceso de líquido de la carne. Guardar la carne cocida.
·         Agregar los ingredientes al filtrado y ajustar a pH 7,0, agregar agua hasta hacer 1000 ml.
·          Filtrar a través de papel filtro poroso. Se puede conservar el caldo y la carne en congelación por separado.
·         Agregar el corazón cocido y picado a tubos de ensaye de 18 x 150 mm o 20 x 150 mm a una altura de 1,2 a 2,5 cm del tubo y adicionar de 10 a 12 ml del caldo.
·        Esterilizar en autoclave 15 minutos a 121ºC. Si este medio se almacena por más de 12 h después de su preparación, debe calentarse a ebullición por 10 minutos y enfriar antes de su uso.




Caldo tripticasa peptona glucosa extracto de levadura (TPGY). Medio selectivo


Cuadro 2: Formula de caldo TPGY
Componente
Cantidad
Tripticasa
50 g 
Peptona
5 g
Glucosa
4 g
Extracto de levadura
20 g
Tioglicolato de sodio
1 g
Agua destilada
1000 ml

Modo de preparación

·         Disolver los ingredientes en agua caliente, enfriar y ajustar a pH 7,2.
·         Distribuir en volúmenes de 21 ml en tubos de 20 x 150 mm con tapón de rosca.
·         Esterilizar por vapor
·         Enfriar a la temperatura y almacenar a 4ºC hasta 6 semanas. Si se almacena más de 12 h, tratarlos con calor

Caldo tripticasa peptona glucosa extracto de levadura adicionado con tripsina (TPGYT). Medio selectivo

Cuadro 3. Formula del caldo TPGYT
Componente
Cantidad
Tripticasa
50 g
Peptona
5 g
Glucosa
4 g
Extracto de levadura
20 g
Tioglicolato de sodio
1 g
Agua destilada
1000 ml


Modo de preparación

·         Disolver los ingredientes en agua caliente, enfriar y ajustar a pH 7,2.
·         Distribuir en volúmenes de 2 ml en tubos de 20 x 150 mm con tapón de rosca.
·         Esterilizar por vapor fluente, enfriar a la temperatura y almacenar a 4ºC hasta 6 semanas. Si se almacena más de 12 h. tratarlos con calor
·         Agregar 1,5 ml de solución de tripsina al 1,4% por cada tubo con 21 ml del medio TPGY. Mezclar muy suavemente. Este medio no se puede almacenar.


Agar hígado de ternera


Cuado 4: Formula Agar de hígado de ternera
Componente
Cantidad
Infusión de hígado
50 g
Infusión de ternera
500 g
Proteosa peptona
20 g
Neopeptona
1,3 g
Triptona
1,3 g
Dextrosa
5,0 g
Almidón soluble
10,0 g
Caseína isoeléctrica
2,0 g
Cloruro de sodio
5,0 g
Nitrato de sodio
2,0 g
Gelatina
20,0 g
Agar
15,0 g
Agua destilada
1000 ml

Modo de preparación

·         Calentar con agitación constante hasta dilución completa.
·         Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121ºC, pH final 7,3 0,2.
·         Agregar por cada 500 ml del medio base fundido 40 ml de la suspensión salina de yema de huevo.
·         Mezclar y vaciar a cajas de Petri estériles de 15 x 100 mm (aproximadamente 15 - 20 ml).
·         Secar las placas a temperatura del laboratorio por 2 días o a 35ºC por 24 horas.
·         Verificar esterilidad de las placas.
·         Almacenar en refrigeración.

Emulsión al 50% de yema de huevo.
·        Lavar los huevos con un cepillo suave y dejar escurrir. Sumergirlos por 1 hora en solución de cloruro mercúrico al 0,1%, escurrir. Sumergir en una solución de etanol al 70% y dejar durante 30 minutos, escurrir. Abrir los huevos en condiciones asépticas y descartar las claras. Colocar las yemas en un recipiente estéril y mezclar con igual volumen de solución salina fisiológica (0,85%) estéril. Guardar en refrigeración hasta su uso.


Agar para esporulación de Eklund.
Cuadro 5. Formula Agar para esporulación de Eklund
Componente
Cantidad
Tripticasa
4 g
Peptona
1 g
Glucosa
0,1 g
Extracto de levadura
1 g
Aga
4 g
Agua destilada
200 ml








Modo de preparación:

·         Disolver los ingredientes en agua caliente, excepto el agar.
·        Ajustar a pH 7,8,   
·         Agregar el agar.         
·         Esterilizar por vapor y enfriar a 50ºC.
·          Agregar 2 ml de solución al 10% de clorhidrato de cisteína, esterilizada por filtración; 12 ml de emulsión de yema de huevo y 2 ml de sangre citratada de bovino o borrego.
·         Preparar las placas.
*Este medio es particularmente adecuado para la esporulación de C. botulinum del grupo II

Agar para asilamiento de C. botulinum (CBI).


·         El agar CBI es una modificación del medio agar McClung Toabe para el aislamiento selectivo y diferencial de C. botulinum, el cual puede aislarse de los cultivos toxigénicos de CMM, provenientes de muestras de heces, líquido gástrico o alimentos.
·         El medio de agar CBI contiene:
Cicloserina 250 g/ml
Sulfametoxazol 76 g/ml
Trimetroprim 4 g/ml
·         Todo esto en la base del medio agar McClung Toabe yema de huevo.



Agar McClung Toabe


Cuadro 6: Formula Agar McClung Toabe

Componente
Cantidad
Proteosa peptona
40 g
Bacto dextrosa
2 g
Fosfato de sodio dibásico
1 g
Fosfato de potasio monobásico
1 g
Cloruro de sodio
2 g
Sufato de magnesio
0,1 g
Agar
25 g
Agua destilada (pH final 7,6 ± 0,2 a 25ºC)
1000 ml
Extracto de levadura
5 g
Suspensión de yema de huevo
100 ml




SOLUCION DE ANTIBIOTICOS

Cicloserina 250 mg o 25 ml de una solución al 0,1%
Sufametoxasol 76 mg o 4 ml de una solución al 1,9%
Disolver el sulfametoxazol en solución 2 N de NaOH.

Lactato deTrimetroprim 4 mg o 4 ml de una solución al 0,1%
por cada 100 ml de medio base

Esterilizar por filtración.
Modo de Preparación:
·         Agregar el extracto de levadura y los ingredientes del agar McClug Toabe a un matraz de 2 L con 900 ml de agua destilada,
        ·          Mezclar y calentar hasta disolución. Ajustar a pH 7,5. Esterilizar 15 minutos a 121ºC en autoclave.
·        Enfriar a 55ºC en baño de agua y en condiciones asépticas agregar 100 ml de la suspensión al 50% de yema de huevo.
·         Agregar los volúmenes necesarios para conservar la concentración de antibióticos por litro de media base.
·         Mezclar y distribuir en cajas de Petri estériles de 15 x 100 mm aproximadamente 15-20 ml por placa.
·         Dejar solidificar y colocar en bolsas de plástico.
·         Guardar en refrigeración hasta su uso. Estas placas pueden almacenarse hasta 1 mes aproximadamente.
Nota :
·         Si los cultivos son toxigénicos, se debe Sembrar directamente en agar hígado de ternera yema de huevo o en agar para el aislamiento de Clostridium botulinum (CBI),
·         el caso de ausencia de esporas, reincubar los tubos (Eklund).Seleccionar colonias bien aisladas sobre el agar hígado de ternera yema de huevo que presenten un halo opaco indicativo de lipolisis y pasarlas a caldo TPGY. Seleccionar otras colonias del medio agar para el aislamiento de C. botulinum rodeadas de un halo opaco con brillo aperlado y pasar a caldo TPGY. Incubar a 30ºC durante 5 días.