Técnica o técnicas de aislamiento a utilizar

Según la Norma Oficial Mexicana NOM-129-SSA1-1995 el procedimiento de aislamiento a seguir es el siguiente.

Después de preparar quitar el exceso de aire disuelto en los tubos preparados con medio caldo carne cocida (CMM) y caldo glucosa peptona tripticasa extracto de levadura (TPGY), mediante calentamiento en baño de agua a ebullición por 10 minutos y enfriar antes de usarlos.  Asegurarse de que las tapas de los tubos estén flojas al hacer este proceso.

Agregar a los tubos de TPGY 1,5 ml de una solución de tripsina al 1,4% y mezclar suavemente y marcar con una T (TPGYT). A los tubos de CMM marcarlos con 1 y 2; y 3 y 4 a los tubos con TPGYT.

Cualquier tipo de muestra incluyendo los sedimentos, pueden servir como inóculo; éstos además tienen la ventaja de que no  contienen inhibidores potenciales, los cuales se han eliminado junto con el sobrenadante, de aquí que los sedimentos pueden contener  grandes cantidades de microorganismos por unidad de volumen.

Colocar aproximadamente 1 g de inóculo a cada uno de los tubos 1 a 3, calentar el tubo No. 2 en baño de agua a 75ºC por 20  minutos para seleccionar esporas resistentes al calor.

Para seleccionar esporas sensibles o resistentes al calor, suspender aproximadamente 1 g del inóculo en un volumen de 10 a 20  ml de solución de etanol al 50%, o mezclar el inóculo, cuando la muestra es líquida 1:1 con etanol absoluto o de 96%. Mantener las  suspensiones o mezclas a temperatura ambiente por 60 minutos, centrifugar a 14000 x g durante 15 minutos, y pasar el sedimento al  tubo No. 4.

Incubar los tubos a 35ºC por 24 horas y a 30ºC por 4 días. Centrifugar aproximadamente 10 mL de cultivo a 15000 x g durante 20  minutos. Esterilizar el sobrenadante por filtración a través de membranas de 0,45 µ m, con ayuda de una jeringa desechable. Diluir el filtrado 1:5 con solución amortiguadora de fosfatos con gelatina. 

Si fuera necesario neutralizar con antisuero tipo F, el cual es relativamente débil, determinar la toxicidad y diluir con solución  amortiguadora de fosfatos de gelatina el sobrenadante a aproximadamente 10 DLR/mL. Mezclar volúmenes de 1,25 ml con 0,25 ml de antisuero F. Inyectar 0,5 mL sin antisuero y 0,6 mL con antisuero.

El aislamiento de cepas productoras de botulismo, se facilita si se dan todas las condiciones para la producción de toxina. Si los  cultivos de los tubos Nos. 2 o 4 son toxigénicos, uno de éstos debe seleccionarse. Sembrar directamente en agar hígado de ternera  yema de huevo o en agar para el aislamiento de Clostridium botulinum (CBI), en estos medios no se ha observado un  enmascaramiento por microflora atípica. En el caso de que predominara flora atípica combinada con la presencia de algunas esporas  de C. botulinum, el inóculo debe hacerse previo tratamiento con etanol. En el caso de ausencia de esporas, reincubar los tubos de  enriquecimiento o pasar al medio de esporulación (Eklund).

Hacer una tinción de Gram de los cultivos tóxicos. Si los cultivos 2 y 4 son tóxicos, pueden excluirse los tubos 1 y 3.

Seleccionar los cultivos sobre las siguientes bases:

i) Bacilos gram positivos atípicos.

ii) Número de bacilos gram positivos con esporas. Si en la tinción se observa un mínimo de 10% de bacilos gram positivos, inocular una  asada en agar hígado de ternera-yema de huevo y en agar CBI. Incubar en anaerobiosis a 30ºC por 48 horas.

NOTA: Es importante tomar en cuenta que cultivos viejos de C. botulinum pueden aparecer como Gram negativos.

Seleccionar  5 colonias bien aisladas sobre el agar hígado de ternera yema de huevo que presenten un halo opaco indicativo  de lipolisis y pasarlas a caldo TPGY. Seleccionar otras 5 colonias del medio agar para el aislamiento de C. botulinum rodeadas de un  halo opaco con brillo aperlado y pasar a caldo TPGY. Incubar a 30ºC durante 5 días. Hacer pruebas para determinar las toxinas como  se indica en 4.6, inocular por duplicado los cultivos toxigénicos en agar hígado de ternera yema de huevo, incubar una placa en  anaerobiosis y otra en aerobiosis para asegurar pureza. 


NOTA: Es necesario inocular un gran número de colonias, debido a que C. botulinum puede enmascararse por otros clostridia que presentan características coloniales similares.

Si en la tinción de Gram se observan bacilos gram positivos con esporas, mezclar 2 ml del cultivo, con 2 ml de etanol al 96%, y dejar a temperatura ambiente por 60 minutos. Inocular una asada en agar hígado de ternera yema de huevo y en agar aislamiento de C. botulinum.