Medios de cultivo para Clostridium botulinum
Medio carne cocida (CMM)
Cuadro 1. Formula del medio carne cocida
Componente
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Cantidad
|
Corazón de res
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454 g
|
Proteosa peptona
|
20 g
|
Bactodextrosa
|
2 g
|
Cloruro de sodio
|
5 g
|
Extracto de corazón de res
|
1000 ml
|
Modo de preparación:
·
Picar
el corazón de res, sumergir en agua y calentar hasta ebullición durante 1 h.
Enfriar, ajustar el pH a 7,0, y hervir 10 minutos ç
·
Filtrar
a través de muselina y presionar para drenar el exceso de líquido de la carne.
Guardar la carne cocida.
·
Agregar
los ingredientes al filtrado y ajustar a pH 7,0, agregar agua hasta hacer 1000
ml.
·
Filtrar a través de papel filtro poroso. Se
puede conservar el caldo y la carne en congelación por separado.
·
Agregar el corazón
cocido y picado a tubos de ensaye de 18 x 150 mm o 20 x 150 mm a una altura de
1,2 a 2,5 cm del tubo y adicionar de 10 a 12 ml del caldo.
· Esterilizar en autoclave
15 minutos a 121ºC. Si este medio se almacena por más de 12 h después de su
preparación, debe calentarse a ebullición por 10 minutos y enfriar antes de su
uso.
Caldo tripticasa peptona glucosa extracto de levadura (TPGY). Medio selectivo
Cuadro 2: Formula de caldo TPGY
Componente
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Cantidad
|
Tripticasa
|
50 g
|
Peptona
|
5 g
|
Glucosa
|
4 g
|
Extracto de levadura
|
20 g
|
Tioglicolato de sodio
|
1 g
|
Agua destilada
|
1000 ml
|
Modo de preparación
·
Disolver los
ingredientes en agua caliente, enfriar y ajustar a pH 7,2.
·
Distribuir en volúmenes
de 21 ml en tubos de 20 x 150 mm con tapón de rosca.
·
Esterilizar por vapor
·
Enfriar a la temperatura
y almacenar a 4ºC hasta 6 semanas. Si se almacena más de 12 h, tratarlos con
calor
Caldo tripticasa peptona glucosa
extracto de levadura adicionado con tripsina (TPGYT). Medio selectivo
Cuadro 3. Formula del caldo TPGYT
Componente
|
Cantidad
|
Tripticasa
|
50 g
|
Peptona
|
5 g
|
Glucosa
|
4 g
|
Extracto de levadura
|
20 g
|
Tioglicolato de sodio
|
1 g
|
Agua destilada
|
1000 ml
|
Modo de preparación
·
Disolver los
ingredientes en agua caliente, enfriar y ajustar a pH 7,2.
·
Distribuir en volúmenes
de 2 ml en tubos de 20 x 150 mm con tapón de rosca.
·
Esterilizar por vapor
fluente, enfriar a la temperatura y almacenar a 4ºC hasta 6 semanas. Si se
almacena más de 12 h. tratarlos con calor
·
Agregar 1,5 ml de
solución de tripsina al 1,4% por cada tubo con 21 ml del medio TPGY. Mezclar
muy suavemente. Este medio no se puede almacenar.
Agar hígado de ternera
Cuado 4: Formula Agar de hígado de ternera
Componente
|
Cantidad
|
Infusión de hígado
|
50 g
|
Infusión de ternera
|
500 g
|
Proteosa peptona
|
20 g
|
Neopeptona
|
1,3 g
|
Triptona
|
1,3 g
|
Dextrosa
|
5,0 g
|
Almidón soluble
|
10,0 g
|
Caseína isoeléctrica
|
2,0 g
|
Cloruro de sodio
|
5,0 g
|
Nitrato de sodio
|
2,0 g
|
Gelatina
|
20,0 g
|
Agar
|
15,0 g
|
Agua destilada
|
1000 ml
|
Modo de preparación
·
Calentar con agitación
constante hasta dilución completa.
·
Esterilizar en autoclave
por 15 minutos a 121ºC, pH final 7,3 0,2.
·
Agregar por cada 500 ml del
medio base fundido 40 ml de la suspensión salina de yema de huevo.
·
Mezclar y vaciar a cajas
de Petri estériles de 15 x 100 mm (aproximadamente 15 - 20 ml).
·
Secar las placas a
temperatura del laboratorio por 2 días o a 35ºC por 24 horas.
·
Verificar esterilidad de
las placas.
·
Almacenar en
refrigeración.
Emulsión
al 50% de yema de huevo.
· Lavar los huevos con un cepillo suave y dejar
escurrir. Sumergirlos por 1 hora en solución de cloruro mercúrico al 0,1%,
escurrir. Sumergir en una solución de etanol al 70% y dejar durante 30 minutos,
escurrir. Abrir los huevos en condiciones asépticas y descartar las claras.
Colocar las yemas en un recipiente estéril y mezclar con igual volumen de
solución salina fisiológica (0,85%) estéril. Guardar en refrigeración hasta su
uso.
Agar para esporulación de Eklund.
Cuadro 5. Formula Agar
para esporulación de Eklund
Componente
|
Cantidad
|
Tripticasa
|
4
g
|
Peptona
|
1
g
|
Glucosa
|
0,1 g
|
Extracto
de levadura
|
1
g
|
Aga
|
4
g
|
Agua
destilada
|
200
ml
|
Modo de preparación:
· Disolver los ingredientes en agua caliente,
excepto el agar.
· Ajustar a pH 7,8,
· Agregar el agar.
· Esterilizar por vapor y enfriar a 50ºC.
· Agregar 2 ml de solución al
10% de clorhidrato de cisteína, esterilizada por filtración; 12 ml de emulsión
de yema de huevo y 2 ml de sangre citratada de bovino o borrego.
· Preparar las placas.
*Este medio es
particularmente adecuado para la esporulación de C. botulinum del grupo II
Agar para asilamiento de C. botulinum
(CBI).
·
El agar CBI es una
modificación del medio agar McClung Toabe para el aislamiento selectivo y
diferencial de C. botulinum, el cual puede aislarse de los
cultivos toxigénicos de CMM, provenientes de muestras de heces, líquido
gástrico o alimentos.
·
El medio de agar CBI
contiene:
Cicloserina 250 g/ml
Sulfametoxazol 76 g/ml
Trimetroprim 4 g/ml
·
Todo esto en la base del
medio agar McClung Toabe yema de huevo.
Agar McClung Toabe
Cuadro 6: Formula Agar McClung Toabe
Componente
|
Cantidad
|
Proteosa peptona
|
40 g
|
Bacto dextrosa
|
2 g
|
Fosfato de sodio dibásico
|
1 g
|
Fosfato de potasio monobásico
|
1 g
|
Cloruro de sodio
|
2 g
|
Sufato de magnesio
|
0,1 g
|
Agar
|
25 g
|
Agua destilada (pH final 7,6 ± 0,2 a 25ºC)
|
1000 ml
|
Extracto de levadura
|
5 g
|
Suspensión de yema de huevo
|
100 ml
|
SOLUCION DE ANTIBIOTICOS
Cicloserina
250 mg o 25 ml de una solución al 0,1%
Sufametoxasol 76 mg o 4 ml de una solución al 1,9%
Disolver el sulfametoxazol en solución 2 N de NaOH.
Sufametoxasol 76 mg o 4 ml de una solución al 1,9%
Disolver el sulfametoxazol en solución 2 N de NaOH.
Lactato
deTrimetroprim 4 mg o 4 ml de una solución al 0,1%
por cada 100 ml de medio base
por cada 100 ml de medio base
Esterilizar por filtración.
Modo de Preparación:
·
Agregar el extracto de levadura y los
ingredientes del agar McClug Toabe a un matraz de 2 L con 900 ml de agua
destilada,
· Mezclar y calentar hasta disolución. Ajustar
a pH 7,5. Esterilizar 15 minutos a 121ºC en autoclave.
· Enfriar a 55ºC en baño de agua y en
condiciones asépticas agregar 100 ml de la suspensión al 50% de yema de huevo.
·
Agregar los volúmenes necesarios para
conservar la concentración de antibióticos por litro de media base.
·
Mezclar y distribuir en cajas de Petri
estériles de 15 x 100 mm aproximadamente 15-20 ml por placa.
·
Dejar solidificar y colocar en bolsas de
plástico.
·
Guardar en refrigeración hasta su uso. Estas
placas pueden almacenarse hasta 1 mes aproximadamente.
Nota :
·
Si los cultivos son toxigénicos, se debe
Sembrar directamente en agar hígado de ternera yema de huevo o en agar para el
aislamiento de Clostridium botulinum (CBI),
·
el caso de ausencia de esporas, reincubar los
tubos (Eklund).Seleccionar
colonias bien aisladas sobre el agar hígado de ternera yema de huevo que
presenten un halo opaco indicativo de lipolisis y pasarlas a caldo TPGY.
Seleccionar otras colonias del medio agar para el aislamiento de C. botulinum
rodeadas de un halo opaco con brillo aperlado y pasar a caldo TPGY. Incubar a
30ºC durante 5 días.
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